关于噬菌体显现VPAC1的亲和力合为各类多肽

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【摘要】目的：血管活性肠肽受体是医学术语，VPAC1的结构比较复杂，需要进行化学方面的认识，而本文将研究噬菌体展示肽库技术筛选VPAC1高亲和力结合十二肽配体，并鉴定关于特异性和亲和力。达到为发展VPAC1靶向的肿瘤新型分子显像剂和靶向内照射治疗制剂的医学基础。采取的措施是随机挑取40个噬菌体克隆进行测序，初步鉴定确定阳性克隆，明确外源十二肽序列，固相合成该十二肽；建立稳定表达VPAC1的真核细胞系；利用噬菌体肽库展示技术进行全细胞差减筛选，利用体外竞争结合ELISA及流式细胞分析，鉴定目标多肽与VPAC1受体结合的特异性及亲和力。结果通过噬菌体展示肽库技术，经过四轮差减筛选，回收噬菌体逐轮得到富集，成功筛选得到与VPAC1高亲和力特异结合十二肽。

【关键词】噬菌体展示肽库筛选   VPAC1高亲和力   结合多肽

目前血管活性肠肽受体（vasoactive intestinal peptide receptor，VIPR）属于七次跨膜G蛋白偶联受体家族，结直肠癌VIPR分子显像常用的分子探针主要为VIP 或VIP 类似物，缺乏对 VPAC1的高选择性，同时存在一定的促肿瘤增殖的风险。随着体外分子展示技术的发展，为寻找和发现与VPAC1高选择性及高亲和力结合的多肽配体奠定了基础。针对筛选得到的目标多肽，利用适合显像或治疗的核素标记，在结直肠癌的分子影像诊断和靶向内照射治疗中有重要应用价值。

1 材料和方法

1.1 主要材料与试剂 HRP-抗M13 单克隆抗体购自GE Healthcare公司；抗VPAC1单克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology 公司；噬菌体随机十二肽库试剂盒（包括噬菌体随机十二肽库，肽库滴度2×1013 pfu/ml ，复杂度2.8×109，E.coli  ER2738宿主菌以及-96gIII 测序引物）购自New England Biolabs公司；中国仓鼠卵巢细胞亚株CHO-K1 购自中科院上海细胞库； G418购自Invitrogen 公司； PrimeScript RT reagent Kit 试剂盒购自TaKaRa 公司；FITC 标记山羊抗兔IgG 购自中杉金桥公司；X-gal购自Amresco；IPTG 购自Merck公司；蛋白酶抑制剂购自ROCHE公司；细胞培养基、胎牛血清及胰酶等购自Hyclone公司；TMB底物显色试剂盒购自康为世纪公司。

1.2 方法

开始 构建稳定表达VPAC1的CHO-K1细胞    用10% 胎牛血清的DMEM高糖培养基将CHO-K1 细胞置37℃，5%CO2 孵箱常规培养，待细胞生长融合至85% 左右，接种96孔板，次日，加不同浓度梯度的G418 筛选培养基，观察两周，确定G418 最佳筛选浓度。其次是稳定表达VPAC1细胞的鉴定将真核重组表达质粒载体pcDNA3.1(+)/VPAC1 进行酶切线性化，取挑选出的生长良好的细胞株扩大培养，按照 RNA抽提试剂盒说明提取总RNA，按TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit 试剂盒说明进行反转录，根据设计的特异性引物检测目的基因VPAC1的表达。最后噬菌体随机十二肽库的全细胞差减筛选，培养CHO-K1/VPAC1及CHO-K1 细胞生长汇合至85% 左右，用含1%BSA 的无血清培养基培养1~2 h，PBS 洗涤1 次，以 0.25%胰酶消化CHO-K1 细胞，1 000 r/min 离心去上清后用3 ml PBS-BSA重悬封闭15 min ，并计数细胞约1×107，同时取 10 μl 噬菌体十二肽库（滴度约2.0×1011 pfu）同样用 PBS-BSA封闭15 min ，加入 500μl 蛋白酶抑制剂于细胞封闭悬液混匀，于37℃缓慢震荡孵育 1.5 h；孵育结束前适时消化阳性CHO-K1/VPAC1 细胞并用同样条件封闭，计数阳性细胞约106~107，将上述阴性细胞孵育液 1 500 r/min 离心2 min；

2 结果

多肽竞争抑制实验结果显示，当用目标多肽VP1 与细胞预孵育后，噬菌体与细胞的结合受到抑制，随着多肽浓度的增加，噬菌体与细胞结合的D（450）值逐渐降低，抑制率呈浓度依赖性。

挑取稳定生长的细胞克隆，扩大培养，提取总 RNA，反转录之后以 VPAC1目的基因设计的特异引物进行PCR ，结果显示，阳性细胞出现特异性目的条带，表明目的基因VPAC1在CHO-K1 细胞稳定表达，噬菌体随机十二肽库的全细胞差减筛选 经过四轮筛选可见回收噬菌体滴度及回收率明显增加，细胞结合及内化噬http://www.quanyouqikan.com菌体均得到显著的富集，而吸附细胞CHO-K1 所结合噬菌体保持低水平并有所下降。随着筛选轮次增加，阳性细胞结合噬菌体回收率从第1 轮2.978×10-6增加到第4 轮1.538×10-3，增加了约516.5 倍，回收噬菌体得到了明显富集。 A：转染组（×200）；B：转染组融合图像（×200）；C：对照组（×200）；D：对照组融合图像（×200） 图2 免疫荧光检测VPAC1的表达

总之随着研究不断的深化，医学的疑难问题也将会一一解决，正在进行放射性核素99mTc标记该十二肽配体，鉴定标记物理化性质，进一步对其进行健康动物及荷瘤动物示踪动力学及显像研究，为奠定发展VPAC1靶向的肿瘤新型分子显像剂和靶向内照射治疗制剂基础。 而随着时间的发展，对于出现更多的问题，也将会在医学发展中，更好更快的解决中，更好的为人类健康服务。

参考文献：

[1] Valdehita A, Bajo A M, Fernandez-Martinez A B, et al. Nuclear localization of vasoactive intestinal peptide (VIP) receptors in human breast cancer[J]. Peptides, 2010, 31(11):2035-2045.

[2]  Reubi J C, Laderach M, Waser B, et al. Vasoactive intestinal peptide/pituitary adenylate cyclase-activating peptide receptor subtypes in human tumors and their tissues of origin[J]. Cancer Res, 2000, 60(11): 3105-3112.

[3]  Muller J M, Debaigt C, Goursaud S, et al. Unconventional binding sites and receptors for VIP and related peptides PACAP and PHI/PHM: an update[J]. Peptides, 2007, 28(9):1655-1666.